Сетевое издание "Медицина и образование в Сибири"
 
 
  

 
№ 4 - 2013 г.
14.00.00 медицинские науки

УДК 615.273.55.015.4-076.9

ИССЛЕДОВАНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ БИОДОСТУПНОСТИ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ТРОМБОВАЗИМ ИЗ ТОЩЕЙ КИШКИ КРЫС

К. И. Ершов1,2, А. А. Серяпина3

1ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава России (г. Новосибирск)
2ФГБУ «Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии» СО РАМН (г. Новосибирск)
3ЗАО «Сибирский центр фармакологии и биотехнологий» (г. Новосибирск)

Целью данного исследования явилось изучение особенности всасывания препарата Тромбовазим из просвета тощей кишки крыс Wistar в систему кровь-лимфа. В работе использован метод инкубации (in situ) препарата, меченного FITC, в просвете дистального отдела тощей кишки. Установлено, что основной путь абсорбции Тромбовазима направлен в кровеносное русло (223,81 ± 129,83 mЕ/мл, p < 0,05). Также обнаружено, что Тромбовазим проникает в лимфатическую систему (19,47 ± 2,33 mЕ/мл, p < 0,05).

Ключевые слова: биодоступность, Тромбовазим, тощая кишка, всасывание, пегелирование, лимфа.


Введение. Создание перорально доступных белковых препаратов и разработка систем их доставки длительное время являлось и остается постоянным вызовом фармакологам. В клинической практике используется много лекарственных препаратов белковой природы, которые применяются преимущественно парентерально ввиду их низкой биодоступности при энтеральном приёме.Парентеральный путь введения традиционный и, с одной стороны, не вызывает много проблем, но, с другой стороны, возможности энтерального приёма медикаментов отличаются лучшей восприимчивостью для пациента, меньшим количеством осложнений. Проблема низкой энтеральной биодоступности белковых лекарственных средствобъясняется рядом физико-химических свойств самих белков, в том числе большим размером молекул, восприимчивостью к ферментативной деградации, коротким периодом полужизни в плазме крови, ионной проницаемостью, иммуногенностью, склонностью к агрегации, адсорбции и денатурации [5]. Кроме того, существует несколько физиологических переменных, которые также влияют на пероральную доставку белковых и пептидных препаратов — интенсивность опорожнения желудка, транзитное время, присутствие пищи, широкий диапазон изменения рН (1–8) в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ), пищеварительные ферменты, кишечная микрофлора и эпителиальный транспорт. Установлено, что абсолютный уровень пероральной биодоступности большинства белков не более 1 %.

Всасывание белковых препаратов через ворсинки кишки может происходить либо в лимфатическую систему, либо в венулы. Определение и/или модуляция этого пути всасывания представляет огромный интерес для развития новых подходов пероральной доставки белков. Заинтересованность в проникновении препаратов в лимфу объясняется тем, что абсорбированный в лимфатическое русло фармакологический агент обходит первичный печеночный метаболизм, которому подвергаются препараты при всасывании из кишечника в кровь. Тем самым биодоступность лекарственного препарата повышается при попадании в лимфу [6].

В данной работе мы сосредоточили свое внимание на особенностях всасывания отечественного препарата Тромбовазим, который представляет собой фармакологическую композицию двух субтилизиновых протеиназ (сериновой и металлопротеиназы) с молекулярной массой 29 кДа, иммобилизованных посредством электронно-лучевого пегилирования. Как было сказано выше, нативные белковые молекулы обладают низкой биодоступностью. Электронно-лучевое пегилирование белковой молекулы повышает её гидрофильность и способствует защите от ферментативного расщепления в ЖКТ, тем самым увеличивая биодоступность при пероральном приёме.

Цель исследования — определить особенности всасывания иммобилизованных посредством электронно-лучевого пегилирования субтилизиновых протеиназ (Тромбовазим) из просвета тощей кишки крыс Wistar в систему кровь-лимфа.

Методы исследования. Наиболее удобным способом оценки всасывания белковых препаратов являются флуоресцентные методы исследования. Изотиоцианат флуоресцеина (FITC) нашел широкое применение в биологии и медицине для создания меток на молекулах пептидов, гормональных белков, ферментов и антител. С помощью этой универсальной метки можно изучить процесс проникновения лекарственных препаратов через ЖКТ. В данной работе перед нами стояла задача экспериментально определить пути транспорта через тощую кишку крыс Wistar протеиназ, меченных FITC, входящих в состав препарата Тромбовазим, что играет важную роль для уточнения особенностей фармакокинетики препарата.

В работе использовали 20 крыс-самцов Wistar в возрасте 6 месяцев. Все животные содержались при естественном освещении на стандартном рационе при свободном доступе к корму и воде.

Для исследования особенностей пути всасывания Тромбовазима у крыс животным под инъекционным наркозом (смесь ксилозина и золетила) после срединной лапаротомии в дистальном отделе тощей кишки с двух сторон фиксировали трубки (входящая, выходящая) для растворов. Длина выбранного фрагмента тощей кишки составляла 15 см, далее просвет промывали физиологическим раствором для удаления химуса и зашивали брюшную полость.

Перед инкубированием растворов в кишке повышали базальную температуру крысы с 34 до 37 °С путем нагревания тела крысы струей теплого воздуха [2].

Для перфузии использовали фосфатно-солевой буфер (ФСБ) c активностью Тромбовазима 0,1 Ед/мл (pH 7,4). После инкубации в тощей кишке в течение 1 ч при постоянной температуре 37,7 ± 1,0 °С из цистерны грудного протока набирали лимфу [3], забор крови осуществлялся из v. mesenterica(непосредственно прилегающей к тощей кишке, где осуществлялась инкубация раствора). Вышеперечисленные биологические жидкости набирали в присутствии гепарина, в дальнейшем их центрифугировали 10 мин на 3000 об./мин, отбирали надосадок и измеряли флуоресценцию на спектрофлуориметре F-3000 (Hitachi, Япония).

Также меченный препарат экстрагировали из прилегающей к области инкубации интерстициальной жидкости кишечника, слизистый слой которого был удален, и из паренхимы лимфатических узлов I порядка. Для этого фрагменты ткани выдерживали в течение суток в ФСБ при 4 °С, далее центрифугировали раствор, чтобы отделить его от остатков ткани и форменных элементов. В надосадочной жидкости определяли флуоресценцию с учетом изначальной массы образца ткани и процента содержащейся в нем воды [1]. В качестве контроля и для установления уровня автофлуоресценции в работе была использована группа интактных крыс (10 животных), с которыми проводили аналогичные хирургические манипуляции, но в качестве раствора для инкубации использовали только ФСБ.

От полученных значений по флуоресценции биологических жидкостей отнимали показатели автофлуоресценции (контрольная группа). Далее количество препарата определялось по калибровочным кривым.

Выведение животных из опыта проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 № 755).

Статистическая обработка результатов включала подсчет среднеарифметических значений (М) и их ошибки (m). Для выявления достоверности полученных значений применяли тест множественных сравнений Дункана (Duncan’s test, ANOVA). В работе использовали пакет компьютерных программ STATISTICA (версия 6.0). Различия считали достоверными при p < 0,05.

Результаты исследования. При исследовании всасывания in situ установлено, что меченный Тромбовазим через 60 мин после начала инкубации в тощей кишке в основном детектируется в плазме крови (рис. 1), а не в лимфе (p < 0,01). Концентрация препарата в плазме крови из v. mesenterica в 10 раз выше, чем в лимфе из цистерны грудного протока.

Нас также интересовал уровень содержания меченного препарата в межклеточной жидкости. Концентрация Тромбовазима в межклеточной жидкости тощей кишки и в паренхиме узлов I порядка статистически не отличаются (рис. 2). Обнаружение протеиназ меченных FITC в лимфоузлах является дополнительным подтверждением пути всасывания препарата в лимфу. Таким образом, нами выявлено, что субтилиназы всасываются из дистального отдела тощей кишки как в системный кровоток, так и лимфатическое русло.

Рис. 1. Особенности всасывания и распределения Тромбовазима, меченного FITC, в биологических жидкостях; * — p < 0,05 отличия между биологическими жидкостями

Рис. 2. Содержание Тромбовазима в межклеточной жидкости кишки и в паренхиме лимфатических узлов

Концентрация меченного Тромбовазима в межклеточной жидкости тощей кишки, лимфатических узлах и лимфе демонстрирует процесс поступления в лимфатическое русло,что является, на наш взгляд, объяснением колоколообразного типа фармакокинетической кривой, установленной в доклинических исследованиях этого лекарственного препарата [4].

Выводы

  1. Установлено, что основной путь всасывания Тромбовазима из просвета тощей кишки направлен в кровеносное русло.
  2. В исследовании установлено, что в межклеточной жидкости тканей тощей кишки и в паренхиме лимфатических узлов I порядка после 1 ч инкубации содержание Тромбовазима составило 10,60 ± 5,65 mЕд/мг.
  3. Выявлено, что субтилиназы, меченные FITC, проникают также из просвета тощей кишки в лимфатическую систему. Лимфа, извлеченная из цистерны грудного протока, содержала 19,27 ± 2,33 mЕд.

Список литературы

  1. Гареев Р. А. Методики исследования гематолимфатического обмена / Р. А. Гареев, И. Б. Беклемишев. — Алма-Ата : Галым, 1991. — 134 с.
  2. Исследование пути всасывания флуоресцеина из тощей кишки крыс Wistar в систему «кровь-лимфа» / К. И. Ершов, В. В. Асташов, О. В. Казаков [и др.] // Вестн. Новосибирского государственного университета. Серия : Биология, клиническая медицина. — 2012. — Т. 10, вып. 4. — С. 41–46.
  3. Кузнецов А. В. Новый способ забора лимфы у животных / А. В. Кузнецов // Бюл. эксперим. биологии. — 1993. — № 9. — С. 329–331.
  4. Антитромботический и тромболитический эффекты нового отечественного протеолитического препарата Тромбовазима / М. Б. Плотников [и др.] // Бюл. эксперим. биологогии. — 2009. — Т. 147, № 4. — С. 418–421.
  5. Emerging trends in oral delivery of peptide and protein drugs / R. I. Mahato, A. S. Narang, L. Thoma, D. D. Miller // Therapeutic Drug Carrier Systems. — 2003. — Vol. 20 (2&3). — P. 153–214.
  6. O’Driscoll C. M. Lipid-based formulations for intestinal lymphatic delivery / C. M. O’Driscoll // Eur. J. Pharm. Sci. — 2002. — Vol. 15 (5). — P. 405–415.

 

Учредитель: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Новосибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО НГМУ Минздрава России)

Государственная лицензия ФГБОУ ВО НГМУ Минздрава России
на образовательную деятельность:
серия ААА № 001052 (регистрационный № 1029) от 29 марта 2011 года,
выдана Федеральной службой по надзору в сфере образования и науки бессрочно

Свидетельство о государственной аккредитации ФГБОУ ВО НГМУ Минздрава России:
серия 90А01 № 0000997 (регистрационный № 935) от 31 марта 2014 года
выдано Федеральной службой по надзору в сфере образования и науки
на срок по 31 марта 2020 года

Адрес редакции: 630091, г. Новосибирск, Красный проспект, д. 52
тел./факс: (383) 229-10-82, адрес электронной почты: mos@ngmu.ru

Выпуск сетевого издания «Медицина и образование в Сибири» (ISSN 1995-0020)
прекращен в связи с перерегистрацией в печатное издание «Journal of Siberian Medical Sciences» (ISSN 2542-1174). Периодичность выпуска — 4 раза в год.

Архивы выпусков «Медицина и образование в Сибири» доступны на сайте с 2006 по 2016 годы, а также размещены в БД РИНЦ (Российский индекс научного цитирования) на сайте elibrary.ru.

Средство массовой информации зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор) —
Свидетельство о регистрации СМИ: ПИ № ФС77-72398 от 28.02.2018.

© ФГБОУ ВО НГМУ Минздрава России, 2020



22.05.2017
Сетевое издание «Медицина и образование в Сибири» преобразовано в печатное издание «Journal of Siberian Medical Sciences». Дата перерегистрации: 18.05.2017. Свидетельство о СМИ: ПИ № ФС 77-69793.
Подробнее >>

03.04.2017
С 2017 года Издательско-полиграфическим центром НГМУ осуществляется выпуск печатного издания «Сибирский медицинский вестник».
Подробнее >>

08.02.2016
Уважаемые авторы! Открыт прием статей во 2-й номер 2016 года (выход номера — середина мая 2016 г.).
Подробнее >>

11.01.2016
Уважаемые авторы! Продолжается прием статей в 1-й номер 2016 года (выход номера — конец февраля 2016 г.).
Подробнее >>

28.12.2015
Уважаемые авторы! Сетевое издание входило в Перечень ВАК до 30 ноября 2015 г. Работа по включению издания в новый Перечень ВАК продолжается.
Информация о формировании Перечня ВАК
Подробнее >>

Архив новостей


Rambler's Top100