Сетевое издание "Медицина и образование в Сибири"
 
 
  

 
№ 2 - 2013 г.
14.00.00 медицинские науки

УДК 616.36-004:546.172.6]-092

ПОКАЗАТЕЛИ СИСТЕМЫ ОКСИДА АЗОТА И МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ПЕЧЕНИ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ЦИРРОЗЕ

А. М. Олещук, А. З. Миколенко, С. В. Трач-Росоловская

ГВУЗ «Тернопольский государственный медицинский университет им. И.Я. Горбачевского» МЗ Украины (г. Тернополь, Украина)

Результаты представленных экспериментальных исследований показали, что в патогенезе цирроза печени важное значение имеет снижение экспрессии эндотелиальной NO-синтазы и нарастание индуцибельной формы фермента, что приводит к повышению образования стабильного метаболита оксида азота нитрит-аниона в крови и его уменьшению в печени. Установлено, что при этом заболевании активируются процессы цитолиза и холестаза с ростом содержания компонентов желчи в крови, нарушается баланс прооксиданты-антиоксиданты, уменьшается активность митохондриальных и микросомальных ферментов, нарастает концентрация провоспалительных цитокинов. Развитие у подопытных животных сформированного цирроза подтверждено морфологически.

Ключевые слова: печень, крысы, экспериментальный цирроз, оксид азота.


Введение. Циррозы печени различной этиологии — это широко распространенные и прогностически крайне неблагоприятные заболевания, количество которых постоянно увеличивается [1]. Морфологически этот патологический процесс характеризуется разрастанием соединительной ткани, перестройкой сосудистого русла паренхимы, гибелью значительной части гепатоцитов.

В патогенезе цирроза печени большое значение имеет развитие оксидативного стресса. Известно, что при этом заболевании возникает гиперпродукция активных форм кислорода: супероксидных, пероксидных и гидропероксидных радикалов, оксида азота (NO) [4]. Последний играет ведущую роль в нарушении системной гемодинамики и формировании портальной гипертензии при циррозе [6].

Целью нашего исследования было изучение состояния печени и показателей системы оксида азота, липопероксидации, детоксикации, митохондиального дыхания, уровня провоспалительных цитокинов при экспериментальном циррозе печени, вызванном длительным введением тетрахлорметана.

Материалы и методы.Исследования проводились на 24-х белых крысах-самцах массой 170–210 г, содержавшихся на стандартном рационе вивария. Эксперименты выполнены в соответствии с положением «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (г. Страсбург, 1986). Цирроз печени был смоделирован по методике, описанной S. Kurabe et al. (1991) [3]. 50 % раствор тетрахлорметана вводили перорально дважды в неделю в течение 3-х месяцев из расчета 2 мл на 1 кг массы животного. В гомогенатах печени определяли содержание ТБК-активных продуктов (ТБК), гидроперекисей липидов (ГПЛ), количество восстановленного глутатиона (GSH), стабильных метаболитов NO — NO2- и NO3-, молочной (лактат) и пировиноградной кислот (пируват), активность супероксиддисмутазы (СОД) [13], каталазы (КАТ), сукцинатдегидрогеназы (СДГ), цитохромоксидазы (ЦХО), N-деметилазную и р-гидроксилазную активность микросом. В сыворотке крови определяли активность АлАТ, АсАТ, щелочной фосфатазы (ЩФ) (стандартные наборы реактивов «Фелисит-диагностика»), каталазы, количество ТБК-активных продуктов, церулоплазмина, стабильных метаболитов NO: NO2- и NO3- [5], мочевины (стандартный набор реактивов «Фелисит-диагностика»), молекул средней массы МСМ1, МСМ2. Иммуноферментным методом (ИФА) с помощью тест-систем USCN Life Science Inc. в гепатоцитах и сыворотке определяли экспрессию эндотелиальной (eNOS) и индуцибельной (iNOS) NO-синтазы. Методом ИФА с помощью адаптированных к виду подопытных животных тест-систем фирмы USCN Life Science Inc. в сыворотке крови крыс определяли уровень провоспалительных цитокинов: интерлейкина-1β (IL-1β), интерлейкина-6 (IL-6) и фактора некроза опухолей-α (TNF-α). Статистическую обработку полученных данных выполняли с помощью Origin 7.5 (OriginLab Corp., США) и Microsoft Excel XP. Сравнение полученных величин проводили с использованием t-критерия Стьюдента и методом однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Изменения считали достоверными при p ≤ 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение. В результате проведенных исследований установлено, что при экспериментальном циррозе печени, вызванном длительным введением тетрахлорметана, в сыворотке крови наблюдается рост активности ферментов, которые являются маркерами поражения печени. Установлено, что активность АлАТ, АсАТ, ЩФ превышала показатели контрольной группы животных в 3,4; 2,9 и 1,3 раза соответственно, что свидетельствует о развитии гепатопатии с проявлениями цитолиза и холестаза. Содержание мочевины в сыворотке крови снижалось на 33,3 %, что указывает на нарушение аргиназного синтеза мочевины в печени при данном типе поражения органа [5]. Содержание компонентов желчи в крови возрастало. Так, концентрация билирубина, холестерина и желчных кислот превышала показатели контроля при циррозе в 1,8; 2,1 и 1,3 раза. Установлено, что при этих патологических условиях отмечается активация процессов липопероксидации, о чем свидетельствовало нарастание в пораженном органе и крови содержания ТБК-активных продуктов (на 56,1 и 94,1 % соответственно) и ГПЛ в печени (на 94,1 %). Одновременно отмечалось снижение активности антиоксидантных ферментов в печени, а именно СОД — на 37,3 % и КАТ — на 48,7 %. Активность последнего в сыворотке крови достоверно возрастала на 50,9 %, что свидетельствует о выходе внутриклеточного фермента во внеклеточное пространство в условиях активного цитолиза. Сывороточный уровень церулоплазмина снижался на 18,6 %, что указывает на подавление синтеза этого медьсодержащего антиоксидантного белка в печени. Содержание GSH в пораженном органе в этой серии эксперимента снизилось на 40,4 % по сравнению с контрольным показателем.

Активность митохондриальных ферментов СДГ и ЦХО снижалась (на 24,0 и 28,9 % соответственно) по сравнению с интактными животными, что свидетельствует о нарушении процессов энергообеспечения гепатоцитов при этом патологическом состоянии. Концентрация молочной кислоты в группе животных с циррозом возрастала на 24,2 %, а пировиноградной — снижалась на 52,0 %, что привело к нарастанию в 2,6 раза соотношения лактат/пируват. Это указывает на нарушение углеводного обмена и активацию анаэробного гликолиза при циррозе. О значительном угнетении процессов детоксикации в печени свидетельствовало снижение скорости процессов N-деметилирования и p-гидроксилирования (на 44,0 и 42,0 % соответственно). Нарастание явлений эндотоксикоза подтверждалось достоверным увеличением уровня обеих фракций молекул средней массы в сыворотке крови: МСМ1 (до 0,71 ± 0,02) у.е. и МСМ2 (до 0,57 ± 0,02) у.е. по отношению к их уровню у особей контрольной группы — (0,42 ± 0,01) и (0,27 ± 0,01) у.е. соответственно.

Все вышеуказанные изменения происходили на фоне уменьшения содержания нитрит аниона в печени на 24,9 % и его нарастания в 3 раза в сыворотке крови. Уровень NO3- в крови возрастал на 23,5 %, а в печени не менялся относительно контроля. Методом ИФА установлено, что содержание эндотелиальной формы NO-синтазы в печени и крови снижалось на 38,8 и 58,6 %, а индуцибельной формы фермента NOS возрастало в 2,5 и 4,1 раза соответственно. Активация iNOS может быть вызвана ростом продукции провоспалительных цитокинов IL-1β, IL-6 и TNFα, уровень которых при циррозе превышал контрольные показатели в 4,0; 4,1 и 5,8 раза (рис. 1).

Рис. 1. Изменения уровня провоспалительных цитокинов в сыворотке крови при циррозе печени
(* — достоверность относительно контроля)

Полученные нами результаты согласуются с данными A. I. Sarela и соавт. (1999), которые установили существенное снижение активности еNOS у больных с циррозом печени, которым проводили трансплантацию органа. Рост уровня NO2- и NO3- в сыворотке крови, который мы получили в наших исследованиях, обусловлен, по нашему мнению, активацией iNOS, экспрессия которой в печени возрастала.

Светооптическое изучение микропрепаратов подтвердило формирование цирроза у животных, которым в течение трех месяцев вводили тетрахлорметан. При гистологическом исследовании ткани печени (рис. 2) выявлено, что структура печеночной дольки была нарушена. Трабекулы гепатоцитов деформированы, cинусоидальные пространства — расширены. Гепатоциты печеночных долек были разными по форме, некоторые из них не содержали ядер, в других — ядра были с резко выраженными явлениями апоптоза. Визуализировались также клетки печени с явлениями компенсаторной гипертрофии. Центролобулярно наблюдалась умеренная белковая и пылеобразная жировая дистрофия. Портальные тракты расширялись за счет выраженного склероза и лимфо-гистоцитарной инфильтрации. В них формировались скопления гепатоцитов с разноформными ядрами, что можно расценить как участки компенсаторной регенерации в виде псевдодолек. Стенки сосудов были склерозированы и гиалинизированы.

Рис. 2. Гистологическая структура печеночной дольки при циррозе печени.
Окраска гематоксилином и эозином, × 160

Выводы

  1. Развитие цирротического поражения в печени морфологически подтверждено наличием выраженного склероза перипоральных полей и формированием псевдодолек.
  2. При экспериментальном циррозе наблюдаются снижение содержания эндотелиальной и нарастание концентрации индуцибельной NO-синтазы, стабильного метаболита оксида азота нитрит-аниона в крови и ее уменьшение в печени.
  3. Цирроз печени сопровождается развитием процессов цитолиза и холестаза с ростом содержания компонентов желчи в крови, нарушения синтеза мочевины, активацией процессов липопероксидации и нарушениями ферментативного и неферментативного звеньев антиоксидантной системы, уменьшением активности митохондриальных и микросомальных ферментов печени, нарастанием эндотоксикоза и содержания провоспалительных цитокинов в крови.

Список литературы

  1. Ткач С. М. Эффективность и безопасность гепатопротекторов с точки зрения доказательной медицины / С. М. Ткач // Здоровье Украины. — 2009. — № 6/1. — С. 7–10.
  2. Hepatic and splanchnic nitric oxide activity in patients with cirrhosis / A. I. Sarela, F. M.A. Mihaimeed, J. J. Batten [et al.] // Gut. — 1999. — Vol. 44. — P. 749–753.
  3. Kurabe S. Systemic histopathology of rats with CCl4-induced hepatic cirrhosis / S. Kurabe, N. Shimazu, M. Inagaki / Laboratory Animals. — 1991. — Vol. 25. — P. 21–25.
  4. Maeda Y. Oxidative stress / Y. Maeda, T. Inoguchi // Nippon Rinsho. — 2010. — Vol. 68, N 5. — P. 814–818.
  5. Morris S. M. Regulation of enzymes of the urea cycle and arginine metabolism / S. M. Morris // Annual Review of Nutrition. — 2002. — Vol. 22. — P. 87–105.
  6. Valance P. Hyperdynamic circulation in cirrhosis: a role of nitric oxide? / P. Valance, S. Moncada // Lancet. — 1991. — Vol. 337. — P. 776–778.

 

Учредитель: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Новосибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО НГМУ Минздрава России)

Государственная лицензия ФГБОУ ВО НГМУ Минздрава России
на образовательную деятельность:
серия ААА № 001052 (регистрационный № 1029) от 29 марта 2011 года,
выдана Федеральной службой по надзору в сфере образования и науки бессрочно

Свидетельство о государственной аккредитации ФГБОУ ВО НГМУ Минздрава России:
серия 90А01 № 0000997 (регистрационный № 935) от 31 марта 2014 года
выдано Федеральной службой по надзору в сфере образования и науки
на срок по 31 марта 2020 года

Адрес редакции: 630091, г. Новосибирск, Красный проспект, д. 52
тел./факс: (383) 229-10-82, адрес электронной почты: mos@ngmu.ru

Выпуск сетевого издания «Медицина и образование в Сибири» (ISSN 1995-0020)
прекращен в связи с перерегистрацией в печатное издание «Journal of Siberian Medical Sciences» (ISSN 2542-1174) — версию печатного издания «Сибирский медицинский вестник» (ISSN 2541-8289) на английском языке. Периодичность выпуска — 4 раза в год.

Архивы выпусков «Медицина и образование в Сибири» доступны на сайте с 2006 по 2016 годы, а также размещены в БД РИНЦ (Российский индекс научного цитирования) на сайте elibrary.ru.

Средство массовой информации зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор) —
Свидетельство о регистрации СМИ: ПИ № ФС77-69793 от 18.05.2017.

© ФГБОУ ВО НГМУ Минздрава России, 2017



22.05.2017
Сетевое издание «Медицина и образование в Сибири» преобразовано в печатное издание «Journal of Siberian Medical Sciences» — версию печатного издания «Сибирский медицинский вестник» на английском языке. Дата перерегистрации: 18.05.2017. Свидетельство о СМИ: ПИ № ФС 77-69793.
Подробнее >>

03.04.2017
С 2017 года Издательско-полиграфическим центром НГМУ осуществляется выпуск печатного издания «Сибирский медицинский вестник».
Подробнее >>

08.02.2016
Уважаемые авторы! Открыт прием статей во 2-й номер 2016 года (выход номера — середина мая 2016 г.).
Подробнее >>

11.01.2016
Уважаемые авторы! Продолжается прием статей в 1-й номер 2016 года (выход номера — конец февраля 2016 г.).
Подробнее >>

28.12.2015
Уважаемые авторы! Сетевое издание входило в Перечень ВАК до 30 ноября 2015 г. Работа по включению издания в новый Перечень ВАК продолжается.
Информация о формировании Перечня ВАК
Подробнее >>

Архив новостей


Rambler's Top100